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微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)篇一
一、考試的總體要求
微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是微生物學(xué)和工業(yè)生物技術(shù)等專業(yè)技術(shù)人才最重要的專業(yè)基礎(chǔ)技能。通過本課程的考核，重點(diǎn)檢查考生對(duì)微生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)技能及其原理和應(yīng)用等掌握情況，主要包括微生物的染色與顯微觀察技術(shù)；微生物的分離純化與培養(yǎng)技術(shù)；微生物生長測(cè)定與生理生化技術(shù)、微生物遺傳育種技術(shù)以及分子微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)等。要求掌握實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理、主要步驟、注意事項(xiàng)以及該實(shí)驗(yàn)技術(shù)的適用對(duì)象等。
二、試題類型及比例
1、簡答題：約40%
2、問答題：約60%
三、考試形式及時(shí)間
考試形式為筆試。考試時(shí)間為3小時(shí)。
四、考試主要內(nèi)容
（一）微生物染色與顯微觀察技術(shù)
1.顯微鏡的使用及維護(hù)
2.細(xì)菌簡單染色、革蘭氏染色、芽孢染色與細(xì)菌形態(tài)觀察
3.酵母菌美蘭染色與酵母細(xì)胞形態(tài)觀察
4.霉菌的形態(tài)觀察
（二）微生物的分離純化與純培養(yǎng)技術(shù)
1.培養(yǎng)基的制備與滅菌（含玻璃器皿的包扎）
2.無菌操作技術(shù)
3.平板劃線、傾注平板與涂布平板分離技術(shù)
（三）微生物生長測(cè)定與生理生化技術(shù)
1.微生物大小與總數(shù)測(cè)定
2.平板菌落計(jì)數(shù)法及其它生長測(cè)定技術(shù)
3.微生物的生理生化試驗(yàn)
4.水的衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)
（四）微生物遺傳育種及分子微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)
1.從自然界中分離篩選特定類型的微生物
2.微生物誘變技術(shù)及特定突變型的篩選
3.微生物原生質(zhì)體制備與融合技術(shù)
4.細(xì)菌質(zhì)粒dna的抽提與電泳檢測(cè)
5.細(xì)菌質(zhì)粒dna的轉(zhuǎn)化
的pcr擴(kuò)增及其產(chǎn)物純化
五、主要參考書目
1.諸葛健，李華鐘主編，微生物學(xué)（第二版，實(shí)驗(yàn)部分），科學(xué)出版社，2009
2.諸葛健，李華鐘，王正祥主編，微生物遺傳育種學(xué)（實(shí)驗(yàn)部分），化學(xué)工業(yè)出版社，2009
3.諸葛健主編，工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)與研究技術(shù)，科學(xué)出版社，2007
微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)篇二
一、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與目的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括：培養(yǎng)基的制備及滅菌；從土壤中分離和純化微生物；細(xì)菌染色及形態(tài)觀察；放線菌、酵母菌和霉菌形態(tài)觀察；微生物顯微計(jì)數(shù)和大小測(cè)量；生長曲線的測(cè)定；細(xì)菌的生理生化反應(yīng)；環(huán)境因素對(duì)微生物生長的影響；微生物的誘變育種；產(chǎn)淀粉酶菌株的分離純化；水和飲料中細(xì)菌學(xué)檢查；食用真菌的采集、分離和培養(yǎng)；抗藥性突變株的篩選。
微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課的目的在于通過一系列實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，使學(xué)生能比較熟練地掌握微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的操作方法和技能；學(xué)會(huì)進(jìn)行綜合實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)、準(zhǔn)備、操作和結(jié)果分析；培養(yǎng)學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)原理、方法和結(jié)果的正確理解，仔細(xì)觀察，認(rèn)真思考的科學(xué)素養(yǎng)和分析問題和解決問題的科學(xué)能力。
二、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室要求與安全
為了確保微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課質(zhì)量，提高實(shí)驗(yàn)效果，并保證實(shí)驗(yàn)室的安全，特提出如下要求，希望共同遵守。
（1）實(shí)驗(yàn)前須預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，了解實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、方法和注意事?xiàng)，寫出實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。在課堂上注意聆聽老師對(duì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的講解，注意觀察教師的示范操作，以掌握實(shí)驗(yàn)操作的要領(lǐng)。
（2）進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須穿工作服，必要時(shí)還須戴口罩、帽子和手套，并做好實(shí)驗(yàn)前的各項(xiàng)準(zhǔn)備工作。
（3）非必需物品禁止帶入實(shí)驗(yàn)室，帶入實(shí)驗(yàn)室的物品應(yīng)遠(yuǎn)離操作區(qū)，放在指定的區(qū)域。
（4）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不準(zhǔn)大聲喧嘩、嬉戲，應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)室的安靜、整潔和有序。不準(zhǔn)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)吸煙、飲水和進(jìn)食，盡量避免用手觸摸頭、面部，防止感染，盡量減少室內(nèi)活動(dòng)，以免引起風(fēng)動(dòng)。
（5）實(shí)驗(yàn)中注意正確使用試劑，按操作規(guī)程使用儀器，遇到儀器故障時(shí)請(qǐng)老師幫助解決，切勿擅自折卸，否則因此而損壞儀器，應(yīng)予以賠償。
（6）用過的污染物品應(yīng)放到指定的地點(diǎn)，經(jīng)專人消毒滅菌之后再進(jìn)行清洗，切勿亂丟或沖入水池中。禁止將本實(shí)驗(yàn)室的物品帶出實(shí)驗(yàn)室外。需送溫箱培養(yǎng)的物品，應(yīng)標(biāo)記好材料名稱、姓名、日期后送到指定位置。
（7）實(shí)驗(yàn)過程中，切勿使用乙醇、乙醚、丙酮等易燃藥品接近火焰。如遇火險(xiǎn)，應(yīng)關(guān)閉電源，用濕布阻燃滅火，必要時(shí)使用滅火器。
（8）實(shí)驗(yàn)完畢后應(yīng)將桌面整理清潔，試劑、儀器放回原處，并將操作臺(tái)擦
拭干凈，打掃衛(wèi)生，關(guān)好水、電、門窗。
（9）離室前脫下工作服，反折放在指定的地方；雙手在2％來蘇液中浸泡5min左右，再用肥皂、清水洗凈，方可離開實(shí)驗(yàn)室。
微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)篇三
微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)安排
第六周： 1.培養(yǎng)基的制備；2.物品的包埋準(zhǔn)備；3.高壓蒸汽滅菌； 第七、八周：4.樣品中微生物的分離；
1.抗生素產(chǎn)生菌的分離與抗菌活性檢測(cè)
2.（土壤中、植物體內(nèi)）拮抗植物病原菌的微生物分離及鑒定
3.高產(chǎn)蛋白酶菌株的分離與酶活性檢測(cè)
4.高產(chǎn)纖維素酶菌株的分離與酶活性檢測(cè)
5.高產(chǎn)脂肪酶菌株的分離與酶活性檢測(cè)
6.高產(chǎn)淀粉酶菌株的分離與酶活性檢測(cè)
7.噬菌體的分離及效價(jià)測(cè)定
8.光合細(xì)菌的分離及鑒定
9.抗藥性菌株的分離及抗藥性測(cè)定（例如如抗青霉素、鏈霉素等常用藥物）
10.（多環(huán)芳烴類、鄰苯二甲酸酯類有機(jī)污染物、苯酚、尿素）高效降解菌的分離鑒定及降解活性檢測(cè)
11.學(xué)生根據(jù)興趣自擬題目
要求：2~3人一組，各組自己查閱相關(guān)資料然后設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案主要包括樣品的采集、所用的培養(yǎng)基配方、分離方法、鑒定的方法、活性測(cè)定的方法等方面；各組長在3月18日前將實(shí)驗(yàn)方案提交給所有指導(dǎo)教師：；魏靜lalsos@；徐耀波 xuyaobo@。郵件主題及文件命名：2010級(jí)*班*組+組長姓名+聯(lián)系電話）
第九周：5.微生物菌落的觀察；6.超凈工作臺(tái)的使用；7.微生物的分離純化；8.水中大腸菌群的檢測(cè)；
第十周：9.口腔微生物的染色觀察與顯微鏡油鏡的使用；
第十一周：10.細(xì)菌的革蘭氏染色；11.放線菌裝片的制作及觀察； 第十二周：12.酵母菌裝片的制作及觀察； 13.霉菌裝片的制作及觀察； 第十三周：14.酸奶的制作
第十四周：開放實(shí)驗(yàn)——目標(biāo)菌株鑒定及活性測(cè)定；
第十五周：實(shí)驗(yàn)考核（無菌操作、制片觀察）；各組匯報(bào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并提交實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目總結(jié)報(bào)告，要求按照正式發(fā)表的科研論文進(jìn)行寫作。
微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)篇四
《土木工程cad》上機(jī)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與要求
一、上機(jī)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（20學(xué)時(shí)）
實(shí)驗(yàn)一基本操作
實(shí)驗(yàn)二基本繪圖命令
實(shí)驗(yàn)三基本編輯命令
實(shí)驗(yàn)四圖形信息的組織與管理
（一）實(shí)驗(yàn)五圖形信息的組織與管理
（二）實(shí)驗(yàn)六繪制建筑平面施工圖
實(shí)驗(yàn)七繪制建筑剖面施工圖
實(shí)驗(yàn)八繪制建筑立面施工圖
二、上機(jī)實(shí)驗(yàn)要求
實(shí)驗(yàn)一熟悉軟件環(huán)境、設(shè)置自己基本繪圖參數(shù)
實(shí)驗(yàn)二能夠熟練使用autocad的基本繪圖命令，包括：點(diǎn)、直線、圓、圓弧、矩形、多邊形等圖形元素的建立方法，多段線的繪制方法，樣條曲線的繪制方法，圖案填充方法
實(shí)驗(yàn)三能夠熟練地建立對(duì)像選擇集，以及使用基本編輯命令，學(xué)會(huì)對(duì)象捕捉與對(duì)象跟蹤方法
實(shí)驗(yàn)四學(xué)會(huì)圖形顯示的特性和控制圖形顯示的幾種方法，及圖層的設(shè)定、線型、線性比例、圖形比例的設(shè)定
實(shí)驗(yàn)五學(xué)會(huì)塊的設(shè)定與插入方法、圖形的外部引用方法、尺寸及文字的標(biāo)注方法
實(shí)驗(yàn)六能夠熟練地運(yùn)用autocad繪制建筑平面施工圖
實(shí)驗(yàn)七能夠熟練地運(yùn)用autocad繪制建筑剖面施工圖
實(shí)驗(yàn)八能夠熟練地運(yùn)用autocad繪制建筑立面施工圖
微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)篇五
細(xì)菌群體生長表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增加或細(xì)胞物質(zhì)的增加。測(cè)定細(xì)胞數(shù)目的方法有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法(direct microscopic count)、平板菌落計(jì)數(shù)法(plate count)、光電比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然數(shù)法(most probable number mpn)以及膜過濾法(membrane filtration)等。測(cè)定細(xì)胞物質(zhì)的方法有細(xì)胞干重的測(cè)定，細(xì)胞某種成分如氮的含量、rna和dna的含量測(cè)定，代謝產(chǎn)物的測(cè)定等?？傊?，測(cè)定微生物生長量的方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，工作中應(yīng)根據(jù)具體情況要求加以選擇。本實(shí)驗(yàn)主要介紹生產(chǎn)、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板菌落計(jì)數(shù)法和光電比濁計(jì)數(shù)法。
一 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法
（一）目的要求
1．明確血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的原理。
2．掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。
（二）基本原理
顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計(jì)菌器)，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內(nèi)外常用的計(jì)菌器有：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、peteroff-hauser計(jì)菌器以及hawksley計(jì)菌器等，它們都可用于酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等懸液的計(jì)數(shù)，基本原理相同。后兩種計(jì)菌器由于蓋上蓋玻片后，總?cè)莘e為0.02mm3，而且蓋玻片和載波片之間的距離只有0.02mm，因此可用油浸物鏡對(duì)細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。除了用這些計(jì)菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細(xì)菌學(xué)檢查。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速、操作簡單。但此法的缺點(diǎn)是所測(cè)得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點(diǎn)，如結(jié)合活菌染色微室培養(yǎng)（短時(shí)間）以及加細(xì)胞分裂抑制劑等方法來達(dá)到只計(jì)數(shù)活菌體的目的。本實(shí)驗(yàn)以血球計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行顯微鏡直接計(jì)數(shù)。另外兩種計(jì)菌器的使用方法可參看各廠商的說明書。
用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。該計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造如圖l5-1。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格(圖15—2)；另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格都是400個(gè)。每一個(gè)大方格邊長為lmm，則每一個(gè)大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，，3(萬分之一毫升)。
圖15—1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造
（一）圖15—2 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造
（二）a.正面圖；b.縱切面圖； 放大后的方格網(wǎng)，中間大方格為計(jì)數(shù)室
1.血細(xì)胞計(jì)數(shù)板；2.蓋玻片；3.計(jì)數(shù)室
計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lml菌液中的總菌數(shù)。
設(shè)五個(gè)中方格中的總菌數(shù)為a，菌液稀釋倍數(shù)為b，如果是25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，則
1ml菌液中的總菌數(shù)=a/5×25×104×b=50000a·b（個(gè)）
同理，如果是16個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，1ml菌液中的總菌數(shù)=a/5×16×104×b=32000a·b（個(gè)）
（三）器材
1．菌種 釀酒酵母
2．儀器或其他用具 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細(xì)滴管。
（四）操作步驟
l．菌懸液制備
以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙骸?/p>
2．鏡檢計(jì)數(shù)室
在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。
3．加樣品
將清潔干燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細(xì)滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。
取樣時(shí)先要搖勻菌液；加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。
4．顯微鏡計(jì)數(shù)
加樣后靜止5min，然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。
調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)，對(duì)于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計(jì)數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。
在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5~10個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格(可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來計(jì)算樣品的含菌量。
5．清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板
使用完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。
（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告
l．結(jié)果
將結(jié)果記錄于下表中。a表示五個(gè)中方格中的總菌數(shù)；b表示菌液稀釋倍數(shù)。
各中格中菌數(shù)ab二室平均值菌數(shù)/ml
12345
第一室
第二室
2．思考題
(1)根據(jù)你的體會(huì)，說明用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的誤差主要來自哪些方面?應(yīng)如何盡量減少誤差．力求準(zhǔn)確?
(2)某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)1～2種可行的檢測(cè)方法。
二平板菌落計(jì)數(shù)法
（一）目的要求
學(xué)習(xí)習(xí)近平板菌落計(jì)數(shù)的基本原理和方法。
（二）、基本原理
平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。但是，由于待測(cè)樣品往往不易完全分散成單個(gè)細(xì)胞，所以，長成的一個(gè)單菌落也可來自樣品中的2～3或更多個(gè)細(xì)胞。因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(colony-forming units，cfu)而不以絕對(duì)菌落數(shù)來表示樣品的活菌含量。
平板菌落計(jì)數(shù)法雖然操作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時(shí)間才能取得，而且測(cè)定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于該計(jì)數(shù)方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(yàn)(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測(cè)。
（三）器材
1．菌種 大腸桿菌菌懸液。
2．培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基。
3．儀器或其他用具lm1無菌吸管，無菌平皿，盛有4.5ml無菌水的試管，試管架，恒溫培養(yǎng)箱等。
（四）操作步驟
l．編號(hào)
取無菌平皿9套，分別用記號(hào)筆標(biāo)明10-
4、10-
5、10-6。(稀釋度)各3套。另取6支盛有4.5ml無菌水的試管，依次標(biāo)是10-
1、10-
2、10-
3、10-
4、10-
5、10-6。
2．稀釋
用lml無菌吸管吸取lml已充分混勻的大腸桿菌菌縣液(待測(cè)樣品)，精確地放0.5ml至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。
optionsemail replies將10-1試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支lml吸管插入10?1試管中來回吹吸菌懸液三次，進(jìn)一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時(shí)不要太猛太快，吸時(shí)吸管伸人管底，吹時(shí)離開液面，以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內(nèi)液體外溢。用此吸管吸取10-1菌液lml，精確地放0.5ml至10-2試管中，此即為100倍稀釋?！溆嘁来晤愅?，整個(gè)過程如圖15-3所示。
放菌液時(shí)吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個(gè)稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結(jié)果誤差較大。
3，取樣
用三支1ml無菌吸管分別吸取10-
4、10-5和10-6。的稀釋菌懸液各lml，對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無菌平皿中，每個(gè)平皿放0.2ml。
不要用lml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀釋菌液放入平皿臼，這樣容易加大同一稀釋度幾個(gè)重復(fù)平板間的操作誤差。
圖15—3平板菌落計(jì)數(shù)操作步驟
4．倒平板．
盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基約15毫升/平皿，置水平位置迅速旋動(dòng)平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或?yàn)R到平皿蓋上。由于細(xì)菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應(yīng)盡快倒入融化并于已冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細(xì)菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計(jì)數(shù)。
待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
5．計(jì)數(shù)
培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個(gè)平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計(jì)算，每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5
一般選擇每個(gè)平板上長有30~300個(gè)菌落的稀釋度計(jì)算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個(gè)重復(fù)對(duì)照的菌落數(shù)不應(yīng)相差很大，否則表示試驗(yàn)不精確。實(shí)際工作中同一稀釋度重復(fù)對(duì)照平板不能少于三個(gè)，這樣便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，減少誤差。由10-
4、10-
5、10-6三個(gè)稀釋度計(jì)算出的每毫升菌液中菌落形成單位數(shù)也不應(yīng)相差太大。
平板菌落計(jì)數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個(gè)連續(xù)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度倒平板培養(yǎng)后所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為好，否則要適當(dāng)增加或減少稀釋度加以調(diào)整。
平板菌落計(jì)數(shù)法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用涂布平板的方式進(jìn)行。二者操作基本相同，所不同的是后者先將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后倒平板，待凝固后編號(hào)，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺(tái)上適當(dāng)吹干，然后用無菌吸管吸取稀釋好的菌液對(duì)號(hào)接種于不同稀釋度編號(hào)的平板上，并盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上20～30min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，然后倒置37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。
涂布平板用的菌懸液量一般以0.1ml較為適宜，如果過少菌液不易涂布開，過多則在涂布完后或在培養(yǎng)時(shí)菌液仍會(huì)在平板表面流動(dòng)，不易形成單菌落。
五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告
1．結(jié)果
2．將培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)結(jié)果填入下表
稀釋度10-410-510-6
cfu數(shù)/平板123平均123平均123平均
每毫升中的cfu
2．思考題
(1)為什么融化后的培養(yǎng)基要冷卻至45℃左右才能倒平板?
(2)要使平板菌落計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，需要掌握哪幾個(gè)關(guān)鍵?為什么?
(3)試比較平板菌落計(jì)數(shù)法和顯微鏡下直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用。
(4)當(dāng)你的平板上長出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時(shí)，你認(rèn)為問題出在哪里?
(5)用倒平板法和涂布法計(jì)數(shù)，其平板上長出的菌落有何不同?為什么要培養(yǎng)較長時(shí)間(48h)后觀察結(jié)果?
三 光電比濁計(jì)數(shù)法
一、目的要求
1．了解光電比濁計(jì)數(shù)法的原理。
2．學(xué)習(xí)、掌握光電比濁計(jì)數(shù)法的操作方法。
二、基本原理
當(dāng)光線通過微生物菌懸液時(shí)，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定的范圍內(nèi)，微生物細(xì)胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測(cè)出(圖15-4)。因此，可用一系列已知菌數(shù)的菌懸液測(cè)定光密度，作出光密度—菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，以樣品液所測(cè)得的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出對(duì)應(yīng)的菌數(shù)。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，菌體計(jì)數(shù)可采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，平板菌落計(jì)數(shù)或細(xì)胞干重測(cè)定等方法。本實(shí)驗(yàn)采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
光電比濁計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是簡便、迅速，可以連續(xù)測(cè)定，適合于自動(dòng)控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細(xì)胞大小、形態(tài)、培養(yǎng)液成分以及所采用的光波長等因素的影響。因此，對(duì)于不同微生物的菌懸液進(jìn)行光電比濁計(jì)數(shù)應(yīng)采用相同的菌株和培養(yǎng)條件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。光波的選擇通常在400~700nm之間，具體到某種微生物采用多少還需要經(jīng)過最大吸收波長以及穩(wěn)定性試驗(yàn)來確定。另外，對(duì)于顏色太深的樣品或在樣品中還含有其他干擾物質(zhì)的懸液不適合用此法進(jìn)行測(cè)定。
圖15—4 比濁法測(cè)定細(xì)胞濃度的原理
（三）器材
1．菌種 釀酒酵母培養(yǎng)液
2．儀器或其他用具 721型分光光度計(jì)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，試管，吸水紙，無菌吸管，無菌生理鹽水等。
（四）操作步驟
1．標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
（1）編號(hào) 取無菌試管7支，分別用記號(hào)筆將試管編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7。
（2）調(diào)整菌液濃度 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)培養(yǎng)24小時(shí)的釀酒酵母菌懸液，并用無菌生理鹽水分別稀釋調(diào)整為每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌數(shù)的細(xì)胞懸液。再分別裝入已編好號(hào)的1至7號(hào)無菌試管中。
（3）測(cè)od值 將1至7號(hào)不同濃度的菌懸液搖均勻后于560nm波長、1cm比色皿中測(cè)定od值。比色測(cè)定時(shí)，用無菌生理鹽水作空白對(duì)照，并將od值填入下表
管號(hào)12345678
細(xì)胞數(shù)106/ml
光密度（od）
每管菌懸液在測(cè)定od值時(shí)均必須先搖勻后再倒入比色皿中測(cè)定
(4)以光密度(od)值為縱坐標(biāo)，以每毫升細(xì)胞數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2．樣品測(cè)定
將待測(cè)樣品用無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋，搖均勻后，用560nm波長、lcm比色皿測(cè)定光密度。測(cè)定時(shí)用無菌生理鹽水作空白對(duì)照。
各種操作條件必須與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的相同，否則，測(cè)得值所換算的含菌數(shù)就不準(zhǔn)確。
3．根據(jù)所測(cè)得的光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得每毫升的含菌數(shù)。
（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告
l．結(jié)果
每毫升樣品原液菌數(shù)=從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得每毫升的菌數(shù)×稀釋倍數(shù)
2．思考題
(1)光電比濁計(jì)數(shù)的原理是什么?這種計(jì)數(shù)法有何優(yōu)缺點(diǎn)?
(2)光電比濁計(jì)數(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中有何應(yīng)用價(jià)值?
(3)本實(shí)驗(yàn)為什么采用560nm波長測(cè)定酵母菌懸液的光密度?如果你在實(shí)驗(yàn)中需要測(cè)定大腸桿菌生長的od值，你將如何選擇波長?
四 大腸桿菌生長曲線的測(cè)定
(一)目的要求
1．通過細(xì)菌數(shù)量的測(cè)量了解大腸桿菌的生物特征和規(guī)律，繪制生長線。
2．復(fù)習(xí)光電比濁法測(cè)量細(xì)菌數(shù)量的方法。
(二)基本原理
大多數(shù)細(xì)菌的繁殖速率很快，在合適的條件下，一定時(shí)期的大腸桿菌細(xì)胞每20min分裂一次。將一定量的細(xì)菌轉(zhuǎn)入新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)細(xì)胞要經(jīng)歷延遲期，對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個(gè)階段。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌數(shù)目的對(duì)數(shù)或生長速率為縱坐標(biāo)作圖所繪制的曲線稱為該細(xì)菌的生長曲線。不同的細(xì)菌在相同的培養(yǎng)條件下其生長曲線不同，同樣的細(xì)菌在不同的培養(yǎng)條件下所繪制的生長曲線也不相同。測(cè)定細(xì)菌的生長曲線，了解其生長繁殖規(guī)律，這對(duì)人們根據(jù)不同的需要，有效地利用和控制細(xì)菌的生長具有重要意義。
用于測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量的方法已在上述實(shí)驗(yàn)作了介紹。本實(shí)驗(yàn)用分光光度計(jì)(spectrophotometer)進(jìn)行光電比濁測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)菌懸浮液的od值，繪制生長曲線。也可以直接用試管或帶有測(cè)定管的三角瓶(圖15-5)測(cè)定“klett units”值的光度計(jì)。如圖15—6所示，只要接種1支試管或1個(gè)帶測(cè)定管的三角瓶，在不同的培養(yǎng)時(shí)間(橫坐標(biāo))取樣測(cè)定，以測(cè)得的klett units為縱坐標(biāo)，便可很方便地繪制出細(xì)菌的生長曲線。如果需要，可根據(jù)公式1 klett units=od/0.002換算出所測(cè)菌懸液的od值。
圖15—5 帶側(cè)臂試管的三角燒瓶
(三)器材
1．菌種 大腸桿菌
2．培養(yǎng)基 lb液體培養(yǎng)基70ml，分裝2支大試管(5ml/支)，剩余60ml裝入250ml的三角瓶。
3．儀器或其他用具 722型分光光度計(jì)，水浴振蕩搖床，無菌試管，無菌吸管等。
圖15—6 直接用試管測(cè)od值
(四)操作步驟
1．標(biāo)記
取11支無菌大試管，用記號(hào)筆分別標(biāo)明培養(yǎng)時(shí)間，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。
2．接種
分別用5ml無菌吸管吸取2.5ml大腸桿菌過夜培養(yǎng)液(培養(yǎng)10~12h)轉(zhuǎn)入盛有50ml lb液的三角瓶內(nèi)，混合均勻后分別取5ml混合液放入上述標(biāo)記的11支無菌大試管中。
3．培養(yǎng)
將已接種的試管置搖床37℃振蕩培養(yǎng)(振蕩頻率250r/min)，分別培養(yǎng)0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，將標(biāo)有相應(yīng)時(shí)間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最后一同比濁測(cè)定其光密度值。
4．比濁測(cè)定
用未接種的lb液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，選用600nm波長進(jìn)行光電比濁測(cè)定。從早取出的培養(yǎng)液開始依次測(cè)定，對(duì)細(xì)胞密度大的培養(yǎng)液用lb液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測(cè)定，使其光密度值在0.1~0.65之內(nèi)(測(cè)定od值前，將待測(cè)定的培養(yǎng)液振蕩，使細(xì)胞均勻分布)。
本操作步驟也可用簡便的方法代替：
1．用1ml無菌吸管取0.25ml大腸桿菌過夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入盛有3~5ml lb液的試管中、混勻后將試管直接插入分光光度計(jì)的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒將試管及比色暗室全部罩上，形成一個(gè)大的暗環(huán)境，另以1支盛有l(wèi)b液但沒有接種的試管調(diào)零點(diǎn)，測(cè)定樣品中培養(yǎng)0h的od值。測(cè)定完畢后，取出試管置37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。
2．分別在培養(yǎng)0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，取出培養(yǎng)物試管按上述方法測(cè)定od值。該方法準(zhǔn)確度高、操作簡便。但須注意的是使用的2支試管要很干凈，其透光程度愈接近，測(cè)定的準(zhǔn)確度愈高。
(五)實(shí)驗(yàn)報(bào)告
1．結(jié)果
(1)將測(cè)定的od600值填入下表：
培養(yǎng)時(shí)間對(duì)照 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20
光密度值od600
(2)繪制大腸桿菌的生長曲線。
2．思考題
(1)如果用活菌計(jì)數(shù)法制作生長曲線，你認(rèn)為會(huì)有什么不同？兩者各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？
(2)細(xì)菌生長繁殖所經(jīng)歷的四個(gè)時(shí)期中，哪個(gè)時(shí)期其代時(shí)最短？若細(xì)胞密度為103/ml，培養(yǎng)4.5h后，其密度高達(dá)2×108/ml，計(jì)計(jì)算出其代時(shí)。
(3)次生代謝產(chǎn)物的大量積累在哪個(gè)時(shí)期？根據(jù)細(xì)菌生長繁殖的規(guī)律，采用哪些措施可使次生代謝產(chǎn)物積累更多？
評(píng)論這張
